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RTCA -DP

 时间(jian):2019-10-17   浏览次数:3650次

细胞入侵和迁移实时测量 RTCADP实时细胞分析仪

xCELLigence®实时细胞分(fen)析(RTCADP仪器(qi)使用无创电阻抗监测,以(yi)无标(biao)签(qian)的实时(shi)方式量(liang)化细胞(bao)增(zeng)殖,形态变化和附着(zhe)质量(liang)。 DP模(mo)型与其他xCELLigence仪器(qi)的(de)区别是其(qi)使用电(dian)子(zi)集成的(de)Boyden室(CIM-Plate®16)进一步对细胞侵袭和迁移(CIM)进行(xing)动力学测量的(de)能(neng)力。 DP仪(yi)器的(de)三个支架(jia)允许三个独立的(de)电子16孔板(ban)并联或彼此独立(li)地(di)进行控制(zhi)和(he)监控,从(cong)而实现多个用户的(de)最(zui)大(da)生产力。将(jiang)仪器置于标准的(de)CO2细胞培养箱中,并通过连接到(dao)孵化器外部的(de)(de)控制单(dan)元(笔记本电(dian)脑)的(de)(de)电(dian)缆进行供电(dian)和控制。用(yong)户友(you)好的(de)(de)RTCA软件允许与所(suo)有三(san)个支架实时接(jie)口(kou),并包括实时数据显示(shi)和分析(xi)功能。

细胞阻抗说明(ming)

在细(xi)胞生(sheng)物化学(xue)测(ce)定(ding)和(he)全身生(sheng)物体(ti)内实验(yan)之(zhi)间定(ding)位,基(ji)(ji)于细(xi)胞的(de)测(ce)定(ding)是基(ji)(ji)础和(he)应用生(sheng)物学(xue)研究(jiu)不可缺少的(de)工具。然而,许多基(ji)(ji)于细(xi)胞的(de)测(ce)定(ding)法的(de)用途通过以下方式(shi)减少了:(1)需(xu)要使用标记;(2)与连续监测不相容(即(ji)仅产生终(zhong)点数据);(3)与(yu)正交试验(yan)不相容;和( 4)无法提供客观/定量的(de)(de)读数。然而,这些缺(que)点都是通过(guo)非侵入性的(de)(de),无标记的(de)(de)和(he)实时(shi)的(de)(de)细(xi)胞阻抗测(ce)定来克服的(de)(de)。 细胞(bao)阻抗测(ce)定(ding)的功(gong)能单(dan)元是融合到微量滴定(ding)板孔(kong)的底部(bu)表面的一组金微电极(图1)。当浸没在(zai)导电(dian)溶液(ye)(ye)(如缓冲液(ye)(ye)或标(biao)准组织培养基)中(zhong)时(shi),在(zai)这些(xie)电(dian)极(ji)上施(shi)加(jia)电(dian)位会(hui)使(shi)电(dian)子离开负极(ji),通(tong)过本体(ti)(ti)溶液(ye)(ye),然后沉(chen)积到正极(ji)端(duan)以完成电(dian)路。因为这种现象取决于电(dian)极(ji)与本体(ti)(ti)溶液(ye)(ye)相(xiang)互(hu)作用,所以在(zai)电(dian)极(ji) - 溶液(ye)界面处的粘附(fu)细(xi)胞(bao)(bao)的存在(zai)阻碍(ai)了电子(zi)流动(dong)。该阻抗的大小取决于细(xi)胞(bao)(bao)的数量,细(xi)胞(bao)(bao)的大小和(he)形状以及细(xi)胞(bao)(bao) - 基底附着(zhe)质量。重要的(de)是,金微电极表(biao)面(mian)和施加(jia)的(de)电位(22 mV)都不影响细胞的(de)健康(kang)或行为。

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1.细胞阻(zu)(zu)抗装(zhuang)置概(gai)述在(zai)(zai)单元格添加之(zhi)前和(he)之(zhi)后显示单个孔的(de)侧(ce)视图。电(dian)极(ji)(ji)和(he)电(dian)池(chi)都不(bu)(bu)被(bei)拉伸(为了(le)清晰起见,它们(men)被(bei)放大)。在(zai)(zai)不(bu)(bu)存(cun)在(zai)(zai)电(dian)池(chi)的(de)情况下,电(dian)流自由(you)流动通(tong)过培养基,完成电(dian)极(ji)(ji)之(zhi)间的(de)电(dian)路(lu)。由(you)于细胞在(zai)(zai)电(dian)极(ji)(ji)上粘附(fu)并增殖,电(dian)流流动受阻(zu)(zu),提(ti)供了(le)细胞数量(liang),细胞大小/形态以(yi)及(ji)细(xi)胞 - 基质附着质量的非(fei)常灵(ling)敏的读(du)数(shu)。

阻(zu)抗(kang)电极

ACEA E-Plate
板中每孔中的金微电(dian)极生物传感器覆盖(gai)70-80%的表面积(ji)(取决于是否存(cun)在视野区域)。而(er)不是图(tu)1所(suo)示的(de)简化的(de)电极(ji)对,E-Plate板的每个孔(kong)中的电极被连接(jie)成形成交(jiao)错阵列(lie)的线(图2)。这种布(bu)置可以(yi)同(tong)时监测(ce)细(xi)胞群体,从而提供精(jing)确(que)的(de)灵敏度:附(fu)着于板的(de)细(xi)胞数,细(xi)胞的(de)大小/形(xing)态以(yi)及细胞 - 基质附着质量。

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2. ACEA E-Plate板(ban)上(shang)的阻抗电极。 AE-Plate板的(de)每个孔中使用的(de)叉指(zhi)电(dian)极(ji)(ji)的(de)简化示意图。电(dian)极(ji)(ji)没(mei)有按比例绘制(仅显(xian)示一(yi)些电(dian)极(ji)(ji),为了清晰起见,它们已(yi)被放(fang)大)。虽然细胞也可以(yi)在(zai)金电(dian)极(ji)(ji)表面上可视化,但在(zai)中间的(de)无电(dian)极(ji)(ji)区(qu)域有助于(yu)显(xian)微成(cheng)像(亮场(chang),荧光等)。 B16E-Plate板中单孔的照片。 C)放大阴影电极和(he)未染色人(ren)体细胞的明场图像。 D)复合显微(wei)镜中(zhong)观(guan)察到的(de)金电(dian)极和结晶紫(zi)染(ran)色(se)的(de)人细胞。

用于实时(shi)细(xi)胞迁移/浸润的设备

尽(jin)管(guan)它(ta)可以与其(qi)他xCELLigence仪器一样运行测试(shi),但是(shi)xCELLigence RTCA DP模型具有使(shi)用ACEA CIM-Plate进行实(shi)时细胞侵袭/迁移测定(ding)的(de)附(fu)加功能,该实(shi)验(yan)基本上(shang)是(shi)电子集成的(de)Boyden室。如图3A所示(shi),将细胞(bao)直接置于微孔膜(mo)的(de)顶部(迁(qian)移测定(ding))上或在预先沉积在膜(mo)上的(de)基底膜(mo)基质和/或细胞(bao)单层的顶部(入侵测(ce)定)上放(fang)置(zhi)在上室中。移(yi)动到下(xia)腔室的化学引(yin)诱剂,细胞(bao)通过微孔膜(mo),然后沉积到金阻抗电(dian)极上(在本技(ji)术概述的前两(liang)节中描述)。这提供了细胞(bao)迁(qian)移(yi)/侵(qin)袭的(de)非常灵敏和(he)可重复的(de)连续动力学(xue)记录(图3B)。使用显微成像定(ding)量迁移细胞(bao)的平行(xing)测定(ding)证(zheng)明了CIM-Plate的阻抗信号与已经迁移的细(xi)胞(bao)数量(liang)之(zhi)间(jian)的完美相(xiang)关性。

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3.细胞侵(qin)袭/迁移的定量实时分(fen)析。 ACIM板细节。上(shang)图显示了(le)CIM-Plate八孔(kong)的(de)剖(pou)视图。下(xia)图中的(de)放大图示(shi)出了单个孔(kong)的(de)上(shang)部和(he)下(xia)部室。上(shang)室的(de)底(di)表(biao)面由细(xi)胞(bao)(bao)可以迁移(yi)穿过的(de)微孔(kong)膜(mo)(mo)组成。该膜(mo)(mo)下(xia)侧的(de)金电极检测粘附细(xi)胞(bao)(bao)的(de)存在(zai)(zai)。对于简单的(de)迁移(yi)测定(ding)(本文未示(shi)出),被监测的(de)细(xi)胞(bao)(bao)将(jiang)直(zhi)接电镀在(zai)(zai)膜(mo)(mo)上(shang)。对于入侵测定(ding)(在(zai)(zai)此显示(shi)),将(jiang)细(xi)胞(bao)(bao)铺在(zai)(zai)基底(di)膜(mo)(mo)基质,细(xi)胞(bao)(bao)单层或其(qi)某些(xie)组合的(de)顶部。 B)在存在或不存在化(hua)学引诱(you)物的情况(kuang)下(xia)实时(shi)分析鼠(shu)巨噬(shi)细(xi)胞迁移。在没有细(xi)胞(阴性对照;蓝线)的情况下(xia),阻抗信号在(zai)测定的75分钟内不(bu)变。虽然一些细胞在(zai)不(bu)存(cun)在(zai)化学引诱物(绿线)的情况下迁(qian)移通过多孔膜,但当化学引诱物存(cun)在(zai)于CIM板的下室(shi)(红线)时,巨噬细胞迁移显着刺激。

实时阻(zu)力跟踪(zong)说明
使用(yong)称为(wei)细胞指数(CI)的无单(dan)位参数报告了由(you)贴壁细胞引起的电子(zi)流(liu)的阻抗,其中CI=(时间点n阻抗-不存在(zai)细胞时阻抗)/标称阻抗值。图(tu)3提供了在建立和(he)运行凋亡实验过程中实时阻抗曲(qu)线的(de)通(tong)用示例(li)。在细胞添加(jia)到孔中的(de)头几个小时之后,阻抗快(kuai)速增(zeng)加(jia)。这是由于(yu)悬浮(fu)液(ye)中的(de)细胞脱落(luo),沉积(ji)在电极上并(bing)形(xing)成局部粘连。如果添加(jia)的(de)细胞的(de)初始数量低(di),并(bing)且(qie)在井(jing)底上存在空(kong)(kong)的(de)空(kong)(kong)间(jian),则(ze)细胞将增(zeng)殖,导致CI逐渐(jian)但稳(wen)定增加。当(dang)细胞达到汇合CI值时,反映(ying)了大容量介质可接近的电极表面积不(bu)再(zai)改变的事实。此(ci)时加(jia)入细胞凋(diao)亡诱导剂导致(zhi)CI降低(di)至零。这是细(xi)胞(bao)(bao)四舍五入,然后从(cong)井底分(fen)离的(de)结果。虽然这个通(tong)用(yong)实例涉及细(xi)胞(bao)(bao)融合(he)时的(de)药(yao)物添加,基于阻(zu)抗的(de)测定是非常灵(ling)活的(de),并且还可以评估初始(shi)细(xi)胞(bao)(bao)粘附(fu)到电(dian)极的(de)速率(lv)和程度,或细(xi)胞(bao)(bao)增殖的(de)速率(lv)和程度。

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4.用(yong)于建立(li)和运(yun)行凋亡测定的通用(yong)实(shi)时阻抗曲线。 在(zai)文中解(jie)释了阻抗曲线的每(mei)个阶段及其产(chan)生的蜂窝行为。

超出上述通用示例(li),图(tu)5显示了使用ACEAxCELLigence 实时无标(biao)记(ji)仪(yi)器中的E-Plate采集的实(shi)际(ji)实(shi)时阻抗数(shu)据。 5A显(xian)示(shi)了将A549细胞(bao)加入到E-Plate板中的(de)前(qian)两小时的(de)阻抗曲线(xian),其中孔预先用不同浓度的(de)胶原(yuan)IV包被(bei)。 虽然图(tu)5B显(xian)示(shi)了在(zai)将HeLa细胞(bao)暴露(lu)于(yu)GPCR激(ji)动剂多巴(ba)胺的前几分钟内发生的细胞指(zhi)数的变(bian)化,图5C评估在20小时(shi)内NK细胞(bao)介导的癌细胞(bao)的细胞(bao)溶解。 5D突出显示根据药物作(zuo)用机(ji)制可能在(zai)细胞指(zhi)数中发生(sheng)的变化(hua)。

//www.aceabio.com.cn/sites/default/files/uploads/images/products/rtca/rtca_s16_tech_4.jpg图(tu)5.使(shi)用E-Plate板和xCELLigence RTCA仪器获得(de)的实时阻抗曲线示例。 A)实(shi)时监测已经预先涂覆不同浓度胶原IVE-Plate孔(kong)的A549细(xi)胞(bao)粘附。请注(zhu)意阻抗值(细(xi)胞(bao)指数(shu))与显微(wei)镜(jing)中可见的贴壁细(xi)胞(bao)数(shu)之间的相关(guan)性。 B)暴(bao)露于不(bu)同浓度GPCR激动剂多巴胺的HeLa细胞的实时阻抗(kang)曲线(xian)。黑色(se)箭头表示多巴胺加(jia)入的时间(jian)。 C)用于NK细胞介导(dao)的MCF7乳腺(xian)癌细胞溶解的实时(shi)阻(zu)抗曲(qu)线(xian)。 D)暴露于药物的A549细胞的实时阻抗曲线显示各种(zhong)作用机制

与细(xi)胞相关的阻(zu)抗

RTCA
提供(gong)细(xi)胞数量,增殖率,细(xi)胞大小/形状和细胞 - 底(di)物附着质量的定量读(du)数。由于这些物理性质是(shi)数千种(zhong)不(bu)同基因(yin)/蛋(dan)白质(zhi)的产物(wu),因(yin)此(ci)RTCA可以为(wei)(wei)细(xi)胞健康和(he)行为(wei)(wei)提供(gong)非常广泛的视野。在xCELLigence仪器上(shang)已经成功(gong)地分(fen)析(xi)了从内皮屏障功(gong)能和趋化(hua)性(xing)到丝状伪(wei)足动力(li)学和免疫细胞介导的(de)细胞溶解的(de)一切。尽(jin)管它们的(de)广(guang)泛性(xing),xCELLigence测定仍然能够询问非常(chang)具体(ti)的生(sheng)化和(he)细胞(bao)现象。适当使用对照和(he)/或正交技(ji)术使(shi)得可以将(jiang)阻抗迹线的特(te)征与特(te)定的细(xi)胞/分(fen)子现象相关联(lian)。

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