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时(shi)间(jian):2019-10-28 浏览次数:3251次
三维图形 xCELLigence RTCA DPlus实时(shi)无标记细胞分析仪
xCELLigence RTCA DPlus实(shi)时无标记细(xi)胞(bao)分(fen)析仪可以实(shi)现(xian)对各种贴壁细(xi)胞(bao)的(de)(de)检(jian)(jian)测(ce),主要包(bao)扩细(xi)胞(bao)迁移(yi)和浸润检(jian)(jian)测(ce)、各种化合(he)物对细(xi)胞(bao)的(de)(de)毒性检(jian)(jian)测(ce)、细(xi)胞(bao)间共培(pei)养检(jian)(jian)测(ce)、细(xi)胞(bao)的(de)(de)生(sheng)长(zhang)增殖检(jian)(jian)测(ce)、细(xi)胞(bao)粘附和伸展检(jian)(jian)测(ce)、受体介(jie)导的(de)(de)信号通路检(jian)(jian)测(ce)等。
RTCA DPlus系统(tong)的(de)动态监测保(bao)证(zheng)了细胞(bao)的(de)瞬时响应(ying)及长(zhang)时效应(ying)的(de)获(huo)取。与(yu)xCELLigence RTCA DP仪器同样,其(qi)使用电(dian)子(zi)集成的Boyden室(CIM-Plate®16)进一(yi)步对细胞侵袭和迁移(CIM)进行动力学测量的能(neng)力。 DPlus仪器的三个支架允许(xu)三个独立的电(dian)子16孔板并联或彼此独立(li)地进行控制(zhi)和监控,从而实现(xian)多个用户的最大生产力。将仪(yi)器置于标准(zhun)的CO2细胞培养箱中,并(bing)通(tong)过连接到外部的(de)控(kong)制单元(笔记本电(dian)脑)的(de)电(dian)缆进行供电(dian)和控(kong)制。用户友好的(de)RTCA软(ruan)件允许与所(suo)有三个(ge)支架实(shi)时接口,并包括实(shi)时数据显示和分(fen)析功能(neng)。
xCELLigence RTCA DPlus实时无(wu)标记(ji)细胞分析(xi)仪的检(jian)测灵敏(min)性和预(yu)测性,实时数据采集特性,检(jian)测周期(qi)的短期(qi)及(ji)长期(qi)检(jian)测优势。
细胞(bao)阻抗说(shuo)明
在细胞(bao)(bao)生物化学(xue)测定(ding)和全身生物体内实(shi)验(yan)之间定(ding)位(wei),基于细胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)测定(ding)是基础和应用生物学(xue)研究不可(ke)缺少(shao)的(de)(de)(de)工(gong)具。然而,许多基于细胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)测定(ding)法(fa)的(de)(de)(de)用途通过以(yi)下方式减少(shao)了:(1)需要使(shi)用标记;(2)与连续(xu)监测不相容(即仅产生终点数据);(3)与正交试(shi)验不相容;和( 4)无法提供(gong)客观/定量的(de)读(du)数。然(ran)而,这些(xie)缺点(dian)都是(shi)通过非侵入(ru)性的(de),无标记(ji)的(de)和实时的(de)细胞阻抗测定来克服的(de)。 细胞阻抗测(ce)定(ding)(ding)的(de)功能单元是融合(he)到微量(liang)滴定(ding)(ding)板(ban)孔的(de)底部(bu)表面的(de)一组金微电极(图1)。当浸没在导(dao)电(dian)溶液(如缓冲液或(huo)标(biao)准组织培养基)中(zhong)时,在这(zhei)些电(dian)极(ji)上施加电(dian)位会使(shi)电(dian)子离开负极(ji),通过本体溶液,然后沉(chen)积到正极(ji)端以完成电(dian)路。因为(wei)这(zhei)种现象取决于(yu)电(dian)极(ji)与本体溶液相互(hu)作(zuo)用,所以在电(dian)极(ji) - 溶液界面处(chu)的(de)粘附细(xi)胞的(de)存在阻(zu)碍了(le)电子流(liu)动。该阻(zu)抗的(de)大(da)小取决(jue)于细(xi)胞的(de)数量,细(xi)胞的(de)大(da)小和形状以及细(xi)胞 - 基(ji)底附着质量。重(zhong)要的是(shi),金微(wei)电极表面和(he)施加的电位(22 mV)都不(bu)影响细胞的健康或(huo)行为。
图1.细(xi)胞阻(zu)抗装置概述在(zai)单(dan)(dan)元格添加之前和(he)(he)之后(hou)显示(shi)单(dan)(dan)个孔的(de)侧视图。电(dian)(dian)极(ji)和(he)(he)电(dian)(dian)池(chi)都不被(bei)拉伸(为了清晰起见,它们被(bei)放(fang)大)。在(zai)不存(cun)在(zai)电(dian)(dian)池(chi)的(de)情况下,电(dian)(dian)流(liu)自由(you)流(liu)动(dong)通过培养基(ji),完(wan)成电(dian)(dian)极(ji)之间的(de)电(dian)(dian)路。由(you)于细(xi)胞在(zai)电(dian)(dian)极(ji)上(shang)粘(zhan)附(fu)并增殖,电(dian)(dian)流(liu)流(liu)动(dong)受(shou)阻(zu),提供了细(xi)胞数(shu)量(liang),细(xi)胞大小/形态(tai)以及(ji)细胞 - 基(ji)质(zhi)附(fu)着质(zhi)量的(de)非常灵敏的(de)读数(shu)。
阻抗电极
ACEA E-Plate板中(zhong)每孔中(zhong)的金微电(dian)极生(sheng)物(wu)传感(gan)器覆盖70-80%的表面(mian)积(ji)(取决于是否存在(zai)视(shi)野区域)。而(er)不是图(tu)1所(suo)示的(de)简(jian)化(hua)的(de)电极对,E-Plate板的每个孔中(zhong)的电极(ji)被(bei)连接(jie)成形成交错阵列(lie)的“线”(图(tu)2)。这种布(bu)置可以同时监测细胞群体(ti),从而提供(gong)精确的灵敏度:附着于板的细胞数,细胞的大小(xiao)/形态(tai)以(yi)及细胞 - 基质附着质量。
图2. ACEA E-Plate板上的阻抗电极(ji)。 (A)E-Plate板的每(mei)个孔中(zhong)使用的叉指电(dian)(dian)(dian)极(ji)的简化示(shi)(shi)意图。电(dian)(dian)(dian)极(ji)没有按比(bi)例绘制(zhi)(仅(jin)显示(shi)(shi)一些电(dian)(dian)(dian)极(ji),为了清晰起见,它(ta)们已被放大)。虽然细胞(bao)也可以在(zai)金电(dian)(dian)(dian)极(ji)表面上(shang)可视化,但在(zai)中(zhong)间的无电(dian)(dian)(dian)极(ji)区域有助于(yu)显微(wei)成(cheng)像(亮场,荧光等)。 (B)16孔E-Plate板(ban)中单孔(kong)的照片(pian)。 (C)放(fang)大阴影电极和未染色人体细胞的明场(chang)图像。 (D)复合显微镜中观察到(dao)的(de)金电极和(he)结晶紫染色的(de)人细胞。
用(yong)于实时(shi)细(xi)胞迁(qian)移/浸润的(de)设(she)备
尽管(guan)它可以与其他xCELLigence仪器一(yi)样运行测(ce)试(shi),但(dan)是xCELLigence RTCA DP模型具有使用(yong)ACEA CIM-Plate进行实时细(xi)胞侵袭/迁移测定的附加功能,该实验基本上是电子(zi)集成的Boyden室。如(ru)图(tu)3A所示,将细胞(bao)直接置于(yu)微孔膜的顶部(迁移测(ce)定(ding))上(shang)或在预先(xian)沉(chen)积在膜上(shang)的基(ji)底(di)膜基(ji)质(zhi)和/或细(xi)胞单(dan)层的顶部(入侵测定)上(shang)放置在上(shang)室(shi)中(zhong)。移动到(dao)(dao)下腔室(shi)的化学引诱剂,细(xi)胞通过微孔膜,然(ran)后沉积(ji)到(dao)(dao)金阻抗电极上(shang)(在本技(ji)术概述的前(qian)两(liang)节中(zhong)描述)。这(zhei)提供了细(xi)胞迁移/侵袭的非常灵敏和可重复的连(lian)续(xu)动力学记录(图3B)。使用显微成像定(ding)(ding)量(liang)迁移(yi)细胞的平行测定(ding)(ding)证明了(le)CIM-Plate的阻抗信号与(yu)已(yi)经迁移的细(xi)胞数(shu)量之(zhi)间的完美相关性。
图3.细胞侵袭(xi)/迁移的定量实(shi)时分析。 (A)CIM板细节。上图显示了(le)CIM-Plate八孔的(de)(de)剖视(shi)图。下图中的(de)(de)放大图示(shi)出(chu)了单个(ge)孔的(de)(de)上部(bu)和下部(bu)室。上室的(de)(de)底表面由细胞(bao)(bao)可(ke)以迁移穿过(guo)的(de)(de)微(wei)孔膜组成。该膜下侧(ce)的(de)(de)金电(dian)极检测粘(zhan)附细胞(bao)(bao)的(de)(de)存在。对(dui)于(yu)(yu)简单的(de)(de)迁移测定(本文未(wei)示(shi)出(chu)),被监测的(de)(de)细胞(bao)(bao)将(jiang)直(zhi)接(jie)电(dian)镀在膜上。对(dui)于(yu)(yu)入(ru)侵测定(在此显(xian)示(shi)),将(jiang)细胞(bao)(bao)铺在基底膜基质,细胞(bao)(bao)单层或其某(mou)些组合(he)的(de)(de)顶部(bu)。 (B)在(zai)存在(zai)或(huo)不存在(zai)化学引(yin)诱物的情况(kuang)下实时(shi)分析鼠巨噬细胞迁移。在(zai)没有细胞(阴性对照;蓝线)的情况下,阻(zu)抗信号在(zai)测定的75分钟内不变(bian)。虽然一些细胞在不存在化(hua)学引(yin)诱(you)物(绿(lv)线(xian))的情况下迁移通过(guo)多孔膜,但当化(hua)学引(yin)诱(you)物存在于(yu)CIM板的下(xia)室(shi)(红线)时,巨噬(shi)细胞迁移(yi)显着刺(ci)激(ji)。
实时阻(zu)力跟踪说明(ming)
使(shi)用称为(wei)细胞指数(CI)的(de)(de)无单位参数(shu)报告了由(you)贴壁细胞引起的(de)(de)电(dian)子流的(de)(de)阻抗,其中CI=(时间点n阻抗-不存在细胞时阻抗)/标称(cheng)阻(zu)抗值(zhi)。图(tu)3提(ti)供了(le)在(zai)(zai)建(jian)立和运行凋亡实验过程中实时阻抗曲线的通用示例。在(zai)(zai)细(xi)胞(bao)添(tian)加(jia)到孔(kong)中的头几个小(xiao)时之(zhi)后,阻抗快速增加(jia)。这是(shi)由于悬浮液中的细(xi)胞(bao)脱(tuo)落,沉积在(zai)(zai)电极上并形成局部粘连。如果(guo)添(tian)加(jia)的细(xi)胞(bao)的初始数量低,并且在(zai)(zai)井底上存在(zai)(zai)空(kong)的空(kong)间,则细(xi)胞(bao)将增殖,导(dao)致CI逐渐但稳(wen)定增(zeng)加(jia)。当细胞达到汇合CI值时,反映了大容量介质可接近的电(dian)极表面积不(bu)再改(gai)变的事实。此时加入(ru)细(xi)胞凋亡诱导剂导致CI降低至(zhi)零。这(zhei)是细(xi)胞(bao)四舍五入,然后从(cong)井底分离的结果。虽然这(zhei)个通用实例涉及细(xi)胞(bao)融合时的药物添(tian)加,基于(yu)阻抗(kang)的测定(ding)是非常灵活的,并且还可以评估(gu)初始(shi)细(xi)胞(bao)粘附到电极(ji)的速(su)率和程度,或细(xi)胞(bao)增殖的速(su)率和程度。
图4.用于建立和运行凋亡(wang)测(ce)定的通(tong)用实时阻抗曲线。 在文中(zhong)解释(shi)了阻抗曲线的每个(ge)阶段及其产生的蜂窝行(xing)为。
超出上述通用示例(li),图5显示了使(shi)用ACEA的(de)xCELLigence 实(shi)时无标(biao)记仪器中(zhong)的E-Plate采集的实际实时(shi)阻抗数据。 图5A显示了将A549细胞加(jia)入到(dao)E-Plate板中(zhong)的前两(liang)小时的阻抗曲线,其中(zhong)孔预先用不同浓度的胶原IV包被。 虽然图5B显示(shi)了在将(jiang)HeLa细(xi)胞(bao)暴露于(yu)GPCR激动剂多(duo)巴胺的(de)前几分钟内发生的(de)细胞指数的(de)变化(hua),图5C评估在(zai)20小时内NK细胞(bao)介(jie)导(dao)的癌细胞(bao)的细胞(bao)溶解。 图5D突出显(xian)示(shi)根据(ju)药物作用机(ji)制(zhi)可能在细胞(bao)指数中(zhong)发生的变(bian)化。
图5.使(shi)用E-Plate板(ban)和xCELLigence RTCA仪器获(huo)得(de)的实时阻抗曲线示例(li)。 (A)实时监测已经(jing)预先涂覆不同浓度胶原IV的(de)E-Plate孔(kong)的A549细胞(bao)(bao)粘附。请注意(yi)阻(zu)抗(kang)值(细胞(bao)(bao)指数)与显微镜中可见的贴(tie)壁细胞(bao)(bao)数之间的相关性。 (B)暴露(lu)于不同浓度GPCR激动剂(ji)多巴胺的HeLa细胞(bao)的(de)实(shi)时阻抗(kang)曲线。黑色箭头(tou)表示多巴胺(an)加入(ru)的(de)时间。 (C)用于(yu)NK细胞介导的MCF7乳腺(xian)癌细(xi)胞(bao)溶解的实时阻抗曲线。 (D)暴露于(yu)药(yao)物(wu)的(de)A549细(xi)胞(bao)的实(shi)时阻抗(kang)曲线(xian)显示各种作用机制。
与(yu)细胞相关的阻抗
RTCA提供细胞数量,增殖率(lv),细胞大小(xiao)/形状(zhuang)和细(xi)胞 - 底(di)物附着质量(liang)的定量(liang)读数(shu)。由于这些物理性质是数(shu)千种(zhong)不同(tong)基(ji)因(yin)/蛋白(bai)质的产物,因此(ci)RTCA可(ke)以为(wei)细胞健康和行为(wei)提供非(fei)常广泛(fan)的视野。在xCELLigence仪(yi)器上(shang)已经成功地分析了从(cong)内(nei)皮屏障(zhang)功能和趋化(hua)性到丝状伪足(zu)动力学和免疫(yi)细(xi)(xi)胞(bao)介导的(de)细(xi)(xi)胞(bao)溶解(jie)的(de)一(yi)切(qie)。尽管它们的(de)广泛性,xCELLigence测定仍然(ran)能(neng)够(gou)询问非(fei)常(chang)具体的生化和(he)(he)细胞现象(xiang)。适当(dang)使用对照和(he)(he)/或(huo)正交(jiao)技术使(shi)得(de)可(ke)以将(jiang)阻抗迹线的(de)特征与特定的(de)细胞/分子现象相关联。